RESUMO

Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria diazotrófica e endofítica capaz de produzir e armazenar em grânulos intracelulares um poliéster biodegradável conhecido como polihidróxibutirato (PHB). Este polímero atua como reserva de carbono e também de potencial redutor, já que a sua mobilização no interior da célula gera acetil-CoA e NADPH. A síntese de PHB ocorre a partir de acetil-CoA em três passos: (i) 2 acetil-CoA são condensados a acetoacetil-CoA, (ii) acetoacetil-CoA é reduzido a 3-hidroxibutiril-CoA consumindo NADPH e (iii) a enzima PHA sintase polimeriza vários 3-hidroxibutiril-CoA formando PHB. Em condições de escassez de nutrientes esses grânulos de reserva são mobilizados através de hidrolases denominadas PHA depolimerases. A PHA depolimerase hidrolisa PHB liberando 3-hidroxibutirato, (ii) o 3-hidroxibutirato é oxidado a acetoacetato formando NADPH, (iii) o acetoacetato é convertido a acetoacetil-CoA e (iv) acetoacetil-CoA é convertido a 2 moléculas de acetil-CoA. No genoma de Herbaspirillum seropedicae foram encontrados 2 genes que codificam para PHA depolimerases, sendo estes, phaZ1 (locus Hsero_1622) e phaZ2 (locus Hsero_0639). O objetivo principal deste trabalho é a construção de estirpes mutantes ?phaZ1, ?phaZ2 e ?phaZ1.2, pela técnica de deleção em fase, para posterior avaliação do efeito das mutações na viabilidade celular e na fixação de nitrogênio. Para construção dos mutantes, fragmentos em torno de 500 pb a montante e a jusante do gene phaZ1 e phaZ2 de H. seropedicae foram amplificados e fusionados por PCR. Os produtos de fusão foram extraídos de gel de agarose e purificados, para posterior clonagem em pTZ18R digerido com SmaI. Os clones obtidos (pTZ18R_?phaZ1 e pTZ18R_?phaZ2) foram confirmados por digestão com as enzimas XbaI e PstI e por sequenciamento de DNA. Os produtos de deleção ?phaZ1 e ?phaZ2 foram extraídos de gel de agarose e purificados para posterior ligação no vetor pK18mobsacB digerido com XbaI e PstI. Após confirmação dos clones em pK18mobsacB, os plasmídeos serão conjugados em H. seropedicae SmR1 para seleção dos mutantes e confirmação por PCR. Os mutantes serão avaliados quanto a sua capacidade de mobilizar os grânulos de PHB em condições de baixo carbono e também se a falta de mobilização de PHB afeta a fixação de nitrogênio.

Palavras-chave: Herbaspirillum seropedicae, Polihidróxibutirato, PHA Depolimerases