RESUMO

Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria endofítica, fixadora de nitrogênio e promotora do crescimento de plantas. Além disso, H. seropedicae produz alguns produtos de interesse biotecnológico como polihidroxibutirato, exopolissacarídeos e ácido indolacético. Essas características tornam esta bactéria um alvo potencial para engenharia metabólica, com o intuito de aplicá-la como inoculante de gramíneas de interesse econômico, tais como, arroz, milho e trigo, bem como em outros processos biotecnológicos. Através da análise do sequenciamento genômico de Herbaspirillum seropedicae, foram localizados genes do sistema de fosfotransferases (PTS – do inglês phosphotransferase system). Este sistema desempenha um papel central na integração dos metabolismos de carbono e nitrogênio em procariotos. Dos genes identificados em H. seropedicae, três deles são homólogos a genes PTS-Ntr de outras bactérias (ptsP EINtr, ptsO NPr, ptsN EIIANtr). Também foi localizado o gene ptsM que expressa uma proteína putativa EIIA tipo-manose (que regula o transporte de manose) e hprK que codifica uma enzima bifuncional quinase/fosfatase que atua na regulação de PTS via fosforilação/defosforilação de PtsO. As permeases EIIB e EIIC que atuam no transporte de carboidratos e, que normalmente são encontradas no sistema PTS de enterobactérias não foram encontradas em H. seropedicae, indicando que o sistema PTS em H. seropedicae tenha um papel preponderantemente regulatório. Os cinco genes do sistema PTS em H. seropedicae foram amplificados e clonados em vetor pTZ18R digerido com SmaI. Os genes ptsM e ptsO já foram sequenciados e subclonados em vetor de expressão pET28a. Os demais genes estão sendo confirmados através de sequenciamento de DNA e serão posteriormente subclonados no vetor pET28a. Os genes ptsM e ptsO foram expressos em E. coli após indução com IPTG. PtsM mostrou-se solúvel e foi purificada por cromotagrofia de afinidade com uma coluna carregada com Ni solúvel nas condições testadas, porém o suficiente para ser purificada por 2+. Já PtsO mostrou-se parcialmente cromatografia de afinidade. A purificação das proteínas do sistema PTS de H. seropedicae e o estabelecimento do ensaio de atividade fosforilase in vitro permitirá uma melhor caracterização deste sistema em bactérias diazotróficas.

Palavras-chave: Clonagem, Expressão, Transformação