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Título
CLONAGEM E SEQUENCIAMENTO DE ILHAS DE CPG DO PROMOTOR DO GENE MMP9 DE LINHAGEM TUMORAL DE MAMA MCF7 TRATADAS OU NÃO COM AGENTE DESMETILANTE DE DNA

Aluno: Mayara Leandro Dutra - PIBIC/CNPq - Curso de Farmácia (MT) - Orientador: Giseli Klassen - Departamento de Patologia Básica - Área de conhecimento: 20804008 - Palavras-chave: câncer de mama; epigenética; mmp9 - Coorientador: Karin Braun Prado - Colaborador: Liliane Maria Bacaro Klassen, Graciele Cristiane More Manica.

O câncer de mama é o tipo mais comum e a principal causa de morte por câncer no mundo entre as mulheres. As metástases causam 90% das mortes a partir de tumores sólidos. No processo de metástase o deslocamento das células tumorais malignas depende a degradação da matriz extracelular (MEC). Este processo é mediado por diversas enzimas destacando-se a metaloprotease de matriz 9 (MMP9). A epigenética está relacionada com a modificação da conformação do DNA e consequente alteração na expressão gênica, sem haver, no entanto, mudança da sequência de nucleotídeos. A hipometilação de citosinas adjacentes a guaninas (CpGs) é um evento epigenético que pode ativar a express agente desmetilante o avaliar oão gênica. O objetivo desse estudo foi clonar e sequenciar uma região rica em CpGs no gene MMP9 e avaliar o efeito da metilação na expressão desse gene na linhagem tumoral MCF7. A linhagem celular foi cultivada até aproximadamente 105 células e foi tratada ou não com agente desmetilante o 5-aza-2-desoxicitina (deasa) por 7 dias. A seguir o DNA foi isolado, tratado com bissulfito de sódio e submetido a uma reação de Nested PCR para amplificar um fragmento de 580 pb que contém 52 CpGs. Os produtos amplificados foram purificados a partir de gel de agarose corado com brometo de etídeo utilizando kit de extração de DNA. Os produtos purificados foram ligados ao vetor pGEMT®easy e incorporado em estirpe de Escherichia coli DH10B por eletroporação. As colônias contendo o inserto foram selecionadas por ?-complementação sendo que as colônias brancas são as que provavelmente contêm o fragmento clonado. Oito colônias de cada tratamento foram então submetidas a PCR de colônia com o resultado visualizado através de gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata. As colônias confirmadas foram crescidas em meio líquido e o DNA foi purificado utilizando kit de extração de DNA plasmidial. Os plasmídeos purificados foram quantificados e submetidos a reação de sequenciamento utilizando kit Big Dye, e após esse procedimento os produtos foram aplicados em sequenciador automático. Resultados. Os dados de sequenciamento mostraram que a linhagem MCF7 que possui baixos níveis de expressão do gene MMP9 tem 50% de metilação na região de DNA estudada. Por outro lado quando esta linhagem foi submetida ao tratamento in vivo com deasa foi observada uma significativa diminuição na metilação de DNA com apenas 15% de metilação global. Estes resultados sugerem pela primeira vez que a metilação do DNA pode ser um fator epigenético que esta envolvido no controle a expressão do gene MMP9.