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Título
CLONAGEM E EXPRESSÃO RECOMBINANTE DA DEUBIQUITINASE USP2A

Aluno: Flávia Gulak Maia - PIBIC/CNPq - Curso de Ciências Biológicas (M) - Orientador: Silvio Marques Zanata - Departamento de Patologia Básica - Área de conhecimento: 20801017 - Palavras-chave: usp2a; deubiquitinase; expressão recombinante - Colaborador: Caroline Fidalgo Ribeiro.

É sabido que a deubiquitinase USP2a é capaz de, entre outras funções, estabilizar formas mutantes do receptor do tipo tirosina-quinase EGFR (epidermal growth factor receptor), presentes em linhagens de tumor de pulmão. Além disso, ela também está envolvida na estabilização da proteína FASN, cuja expressão está aumentada em certos tipos de tumores. Desconhece-se, no entanto, os mecanismos pelos quais a USP2a é direcionada para o microdomínio da célula no qual a estabilização ocorre. Para que se possa estudar o papel desta deubiquitinase na internalização e direcionamento do EGFR, se fez necessário a clonagem e expressão da USP2a em células de procarioto (E. coli BL21 (DE3) STAR). Uma vez desenhado e obtido o par de oligonucleotídeos necessários para a expressão, sua clonagem foi feita por método de PCR, sendo a inserção em plasmídeo pET28a(+). Após a transformação de bactérias eletrocompetentes da estirpe DH5a com o plasmídeo contendo o vetor, clones foram crescidos em meio LB-ágar, contendo antibióticos para seleção, e analisados por PCR. Quatro colônias que de fato continham o inserto foram selecionadas para uma expressão em pequena escala e, como esta foi muito eficiente, a expressão em larga escala foi feita em seguida. Devido ao fato da expressão ter ocorrido em corpos de inclusão, antes da purificação, foi necessário sua solubilização em agente caotrópico, no caso, a uréia. A purificação foi feita por cromatografia de afinidade a metal imobilizado (níquel) e eluição com imidazol. Por eletroforese, verificou-se a adequada imobilização da proteína recombinante na matriz cromatográfica e a obtenção de frações com bom nível de pureza. Por outro lado, estima-se uma perda de 30% no rendimento final, uma vez que parte da proteína permaneceu não ligada à resina NTA-Agarose e não pode ser purificada. Obtida a proteína purificada, foi possível utilizá-la na varredura de dois hibridomas secretores de anticorpos anti-USP2a. Os hibridomas estavam nos estágios iniciais de produção, de modo que foi necessário passar por etapas de diluição limitante para obtenção de um hibridoma secretor clonal. Entretanto, todos os hibridomas mostraram-se instáveis uma vez que deixaram de secretar os anticorpos monoclonais após algumas semanas em cultura.