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Título
PADRONIZAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DA TÉCNICA DE MULTIPLEX RT-PCR PARA GENOTIPAGEM DO ROTAVÍRUS GRUPO A

Aluno: Janaina Lustosa de Mello - Pesquisa voluntária - Curso de Medicina Veterinária - Palotina (MT) - Orientador: Elisabete Takiuchi - Departamento de Medicina Veterinária - Área de conhecimento: 21201013 - Palavras-chave: rotavirus grupo a; diarreia neonatal; rt-pcr e genotipagem - Colaborador: Andressa Fernanda Kunz, Rubia Macedo, Jessica Gallego.

O rotavírus (RV) é reconhecido como o principal agente viral na etiologia das diarreias neonatais dos bezerros. Em bezerros, o RV grupo A (RV gpA) é o mais frequentemente detectado em quadros clínicos de diarreia no período entre o nascimento e o desmame, ocasionando perdas econômicas consideráveis na bovinocultura. A alta concentração de partículas virais excretadas nas fezes durante o período agudo da doença associado à sua particularidade genômica (onze segmentos de RNA de fita dupla) possibilita diagnóstico por meio da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA). Outros métodos moleculares, tais como a amplificação genômica pela técnica de reação em cadeia pela polimerase precedida pela transcrição reversa (RT-PCR) tem sido aplicada tanto para o diagnóstico quanto para a genotipagem de estirpes de RV gp A. A genotipagem do RV gp A está relacionada com a classificação do vírus em genotipos P e G de acordo com a diversidade antigênica encontrada nas proteínas VP4 e VP7, respectivamente. Atualmente são relatados 35 diferentes genotipos P (VP4) e 27 genotipos G (VP7). O presente projeto teve como objetivo padronizar a técnica de Multiplex RT-PCR e genotipar as amostras coletadas em P tipo e G tipo, provenientes de um rebanho com histórico recorrente de diarreia neonatal. Até o momento foram analisadas 63 amostras fecais de aspecto diarreico de bezerras com até 40 dias de idade, coletadas no período entre março de 2013 a fevereiro de 2014, na região Noroeste do Paraná. Alíquotas de suspensões fecais a 10% em tampão TRIS-Cálcio foram submetidas à extração do ácido nucléico pela associação das técnicas fenol clorofórmio - álcool isoamílico associada à sílica-isotiocianato de guanidina e em seguida submetidas à EGPA a 7,5% e corado por nitrato de prata. Até agora foi possível a identificação do RV A pela técnica de EGPA, em 17 amostras. Para a genotipagem dos RV gpA previamente detectados pela EGPA, optou-se pela técnica de Multiplex RT-PCR, com primers específicos para os genotipos G e P mais frequentemente encontrado em animais. Entretanto, até o presente momento, ainda não obtivemos êxito na amplificação genômica das amostras pela Multiplex RT-PCR em nosso laboratório. Considerando as inúmeras causas que podem ser atribuídas a este insucesso, prosseguimos com os testes de experimentação para a conclusão do projeto.