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Título
CLONAGEM DE UMA VARIANTE DO GENE GLNK DE HERBASPIRILLUM  SEROPEDICAE PARA EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL

Aluno: Matheus Felipe Passos - Curso de Ciências Biológicas (N) - Orientador: Rose Adele Monteiro - Departamento de Bioquímica - Área de conhecimento: 20802005 - Palavras-chave: regulaçao da fixação de nitrogênio; glnk; caracterização funcional - Coorientador: Marco Aurelio Schüler de Oliveira - Colaborador: Adriano Alves Stefanello.

Herbaspirillum seropedicae é uma protebactéria gram-negativa diazotrófica capaz de colonizar tecidos internos de plantas com interesse econômico, como trigo, cana de açúcar e arroz. H. seropedicae pode estimular o crescimento da planta hospedeira, tendo alto potencial como biofertilizante. O processo de fixação de nitrogênio exige gasto energético elevado e não acontece eficientemente senão em condições microaeróbias e limitantes de nitrogênio. Para evitar o desperdício energético, diversas proteínas estão envolvidas com a regulação do processo. Entre elas destaca-se NifA, que é uma proteína reguladora transcricional da fixação biológica de nitrogênio. A regulação da atividade da proteína NifA em resposta aos níveis de nitrogênio fixado é mediada pela proteína GlnK. Em baixos níveis de nitrogênio fixado, NifA é ativada por GlnK, e essa ativação é reduzida com o aumento da disponibilidade de nitrogênio fixado. A proteína mutante GlnK P10L (substituição de prolina por leucina na posição 10), obtida por mutagênese aleatória por PCR, foi selecionada pelo seu fenótipo de ativação da proteína NifA. Em um sistema que co-expressava NifA e GlnKP10L a partir do mesmo plasmídeo em Escherichia coli, observou-se que a proteína NifA passou a ser totalmente inibida na presença de amônio, enquanto que na sua ausência NifA era ativa. Para a melhor caracterização dessa mutação, o gene que codifica a proteína mutante está sendo sub-clonado em um vetor de expressão. O gene para expressão de GlnK P10L foi extraído por restrição do vetor de coexpressão pETDUET-1/GlnKP10L/NifA com as enzimas XbaI e BamHI para ligação no vetor de expressão com o promotor T7, pET29-a. Após a clonagem, o clone resultante será transformado na estirpe BL21 de E. coli, a expressão da proteína será induzida, e a mesma será purificada por cromatografia. A proteína purificada será utilizada para experimentos in vitro.