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Título
REGULAÇÃO DO METABOLISMO DE POLIHIDROXIBUTIRATO EM HERBASPIRILLUM SEROPEDICAE

Aluno: Henrique Leonardo Ruchaud Corrêa - PIBIC/CNPq - Curso de Ciências Biológicas (N) - Orientador: Leda Satie Chubatsu - Departamento de Bioquímica - Área de conhecimento: 20802005 - Palavras-chave: herbaspirillum seropedicae; sistema ntr; polihidroxibutirato - Coorientador: Marcelo Müller dos Santos - Colaborador: Emanuel Maltempi de Souza, Fabio de Oliveira Pedrosa.

Herbaspirillum seropedicae é um diazotrofo endofítico capaz de produzir e armazenar em grânulos um poliéster biodegradável conhecido como polihidroxibutirato (PHB), que funciona como reserva de carbono e de potencial redutor na forma de NADPH. Normalmente, altas relações C/N no meio parecem estimular a síntese de PHB. Em H. seropedicae, o metabolismo de nitrogênio é regulado pelo sistema Ntr, composto pela enzima uridililtransferase (GlnD, codificada pelo gene glnD), as proteínas transdutoras de sinal da família PII (GlnB e GlnK, codificadas pelos genes glnB e glnK) a permease de amônio (AmtB, codificada pelo gene amtB) e o sistema de dois componentes NtrB-NtrC (codificado pelos genes ntrB e ntrC). Experimentos anteriores determinaram a porcentagem de produção de PHB por peso seco de bactéria na estirpe selvagem SmR1 e nos mutantes do sistema Ntr. As maiores produções do polímero foram observadas na estirpe ntrC-, tanto em alta quanto em baixa relação C/N, sugerindo que neste mutante a produção de PHB está desacoplada da concentração de nitrogênio do meio. O favorecimento da produção de PHB no mutante ntrC pode ocorrer devido a maior disponibilidade de equivalente reduzido, na forma de NADPH. Para avaliar tal hipótese, a resistência de H. seropedicae SmR1 e ntrC- ao estresse oxidativo foi estimada pelo crescimento das culturas na presença de 20 e 5 mM de NH4Cl como fonte de nitrogênio e diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio (H2O2 0,1 mM; 0,5 mM; 1 mM e 2 mM) a cada 20 minutos ao longo de 12 horas. As curvas de crescimento mostraram que o mutante ntrC- possui maior resistência ao estresse oxidativo em ambos as condições quando comparado com a estirpe parental SmR1, principalmente na presença de 1 mM e 2 mM de H2O2. Estes dados apontam uma maior disponibilidade de NADPH no mutante ntrC-. Novos experimentos estão sendo executados no momento para confirmar essa hipótese. Para verificar se o estado de fosforilação de NtrC pode estar envolvido na maior produção de PHB, está sendo construído um mutante do gene ntrB de H. seropedicae pela técnica de deleção cromossômica em fase, com o intuito de não afetar a transcrição de ntrC. Um produto de deleção do gene ntrB (?ntrB), consistindo de 500 pb a montante e a jusante do gene ligados entre si, foi obtido por PCR. O produto de deleção foi clonado em pTZ18R e a sua sequência de bases foi confirmada por sequenciamento de DNA. O produto de deleção foi subclonado em pK18mobsacB entre os sítios EcoRI e XbaI, originando o plasmídeo pK18ms?ntrB. Este plasmídeo será utilizado para obtenção do mutante ?ntrB.