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Título
CLONAGEM E EXPRESSÃO DE PEPTÍDEOS POTENCIALMENTE INSETICIDA PRESENTE NO VENENO DE ARANHA-MARROM (LOXOSCELES INTERMEDIA)

Aluno: Hanna Câmara da Justa - PIBIC/CNPq - Curso de Ciências Biológicas (N) - Orientador: Silvio Sanches Veiga - Departamento de Biologia Celular - Área de conhecimento: 20601000 - Palavras-chave: aranha marrom; peptídeo inseticida; pichia pastoris - Coorientador: Olga Meiri Chaim - Colaborador: Gabriel Otto Meissner, Adriano Marcelo Morgon, Fernando Hitomi Matsubara.

Aranhas do gênero Loxosceles, conhecidas como aranhas-marrons, são encontradas em diversos locais do Brasil, especialmente endêmica em Curitiba e Região Metropolitana. Em 2012 foram 7.446 casos registrados no país. As aranhas Loxosceles possuem hábitos noturnos e podem ser encontradas em calçados e roupas. Ao ser picado por uma aranha-marrom, pode-se desenvolver um quadro clínico de envenenamento chamado Loxoscelismo, que em casos mais graves pode levar a óbito. A toxina mais estudada do veneno é a fosfolipase-D. Esta e outras foram quantificadas através de um transcriptoma da glândula produtora de veneno. Também foi possível identificar que mais de 50% de todas as toxinas são potencialmente inseticidas. Uma destas toxinas, nomeada NTX é semelhante a uma encontrada na aranha Macrothele gigas chamada Magi3. Este trabalho tem como objetivo clonar e padronizar a expressão da NTX, utilizando um sistema eucarioto de Pichia pastoris e o vetor pPICZC. Essa construção foi transformada em 2 cepas; X33 e KM71H, na primeira, a sequência completa da NTX foi utilizada, enquanto para a segunda foi usada em sua forma madura (sem pró-peptídeo). Colônias transformadas de P. Pastoris foram usadas para inocular 25 mL de meio BYMG, cada cultura foi incubada de 16-20 horas a 30ºC sob agitação de 200 rpm até a absorbância atingir uma DO600=2-6. As células foram recuperadas por centrifugação por 5 minutos a 4000 g em temperatura ambiente. As células foram ressuspendidas em 100 mL de meio BMMY com metanol 0,5%. A indução da expressão da proteína recombinante foi realizada através da incubação das culturas por 96 horas a 30°C sob agitação de 200 rpm. A cada 24 horas a expressão foi suplementada com metanol absoluto para uma concentração final de 0,5%. Ao final dos quatro dias de expressão, as culturas foram centrifugadas e o meio coletado para purificação. Os meios das culturas foram precipitados com sulfato de amônio 80% e centrifugados a 9000 g por 30 min. O precipitado de proteínas foi ressuspendido em tampão de ligação em resina Ni-NTA agarose e realizado a ligação da toxina a resina. Esse processo rendeu aproximadamente 800 μg/L de toxina recombinante da cepa X33. Já na cepa KM71H o rendimento foi em torno de 600 μg/L. Ambas purificações foram injetadas em grilos adultos a fim de se determinar atividade biológica. Em suma, a toxina NTX foi expressa no modelo escolhido, porém, em baixa quantidade em ambas as cepas e não mostraram efeitos tóxicos nos insetos. Novos testes para melhorar o rendimento durante a expressão e testar a atividade biológica serão realizados.