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Título
EXPRESSÃO HETERÓLOGA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE UMA FOSFOLIPASE RECOMBINANTE DE LAGARTA LONOMIA OBLIQUA

Aluno: Brenda Marin - PIBIC/CNPq - Curso de Biomedicina (MT) - Orientador: Olga Meiri Chaim - Departamento de Biologia Celular - Área de conhecimento: 20000006 - Palavras-chave: lonomia obliqua; recombinante; fosfolipasea2 - Coorientador: Silvio Sanches Veiga - Colaborador: Adriano Marcelo Morgon, Gabriel Otto Meissner.

A lagarta Lonomia obliqua, conhecida popularmente por taturana, é responsável por um número elevado de acidentes na Região Sul do Brasil. Erucismo lonômico é o quadro clínico decorrente ao acidente com essas lagartas, o qual varia de reações cutâneas leves a reações sistêmicas graves, que incluem distúrbios hemostáticos, hemorragia intracerebral e insuficiência renal aguda. O veneno dessa lagarta é composto por diversas toxinas e, dentre elas, uma fosfolipase A2 (PLA2). O objetivo do presente estudo é obter esta enzima recombinante através da clonagem e expressão heteróloga e avaliar sua atividade bioquímica e biológica. Em estudos anteriores do grupo, obteve-se a sequência codificante para a fosfolipase-A2,a qual foi clonada em vetor de clonagem pGEM-T e em vetor de expressão pSMT3, para posterior expressão em cepa BL21 STAR (DE3) One Shot. Os resultados obtidos nos revelaram uma baixa concentração da PLA2 recombinante solúvel, a maioria sob a forma de corpos de inclusão, sendo necessário testar outros vetores de expressão, cepas e condições de expressão. Portanto, no presente estudo, buscamos novas estratégias que possibilitem a expressão da forma recombinante da PLA2 de L. obliqua solúvel, ativa e com alto rendimento. Para tal, a construção PLA2/pSMT3 foi transformada em cepa de expressão SHuffle T7 express LysY e também foram testados outros vetores de expressão e, para isso, foram desenhados oligonucleotídeos específicos para a subclonagem em vetores pET-20b e pET-32a. Após a clonagem da construção nesses vetores, confirmada por sequenciamento da construção, realizaram-se dierentes testes de mini-expressão, com diferentes cepas (BL21 STAR (DE3) One Shot, BL21 (DE3) pLySs, AD494 (DE3)) e em diferentes concentrações do indutor IPTG. Os resultados obtidos foram insatisfatórios, já que em algumas expressões não obtivemos a produção da proteína recombinante e em outras ela se encontrava sob sua forma insolúvel, nos levando a mudar as condições novamente. Além disso, já é sabido que a PLA2 apresenta homologia com fosfolipases-A2 presentes em venenos de outros animais, como as abelhas. Em busca de uma análise detalhada, realizou-se uma predição de sua estrutura tridimensional utilizando como modelo o cristal da Apis mellifera. Apesar de todas as clonagens e expressões terem sido realizadas com sucesso, não pode-se realizar os testes de atividade.Nesse sentido, obter essa proteína recombinante solúvel, ativa e com alto rendimento representa alto potencial biotecnológico a fim de elucidar melhor os efeitos do envenenamento por Lonomia obliqua.