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Aluno - Paola Vitalino da Silva - PIBITI/UFPR-TN - Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia (MT) - Orientador : Silvio Marques Zanata - Departamento de Patologia Básica.

Título
CLONAGEM E EXPRESSÃO RECOMBINANTE DA PROTEÍNA CD4 DE AVE

Área de conhecimento: 21100004 - Palavras-chave: aves; salubridade animal ; anticorpos - Colaborador: Max Ingberman.

Com a crescente demanda pelo consumo de aves no mercado mundial, é necessário obter aves com qualidade, e isso implica diretamente na salubridade desses animais. Por isso, é necessário entender o funcionamento do sistema imune desses animais. O CD4 é um receptor presente em linfócitos T helper, que possui um papel importante na produção de anticorpos. Essas células reconhecem os antígenos apresentados em MHCII e liberam citocinas, para estimular a diferenciação das células B em plasmócitos. O objetivo principal desse trabalho é a produção de proteínas recombinadas para a produção de anticorpos capazes de se ligar ao CD4 de galinha possibilitando assim a sua marcação em métodos de análise. Para a expressão da proteína CD4 em sistema heterólogo primeiramente foi realizada uma clonagem. A sequencia da porção extracelular da proteína foi clonada no vetor pET28a e trasnformadas em diferentes cepas de E. coli. Em meio sólido com antibiótico apropriado, foram selecionadas 4 colônias, transferidas para o meio liquido onde cresceram até que atingissem D.O.600nm 0,5~0,8 e a produção de proteina induzida pela adição de IPTG. O produto foi analisado para verificar níveis de proteínas CD4 expressos. A bactéria então foi lisada, purificada por cromatografia de afinidade a metal imobilizado e a proteina purificada foi dosada. Posteriormente, camundongos Balb/c foram imunizados via intraperitoneal 4 vezes com intervalos de 14 dias. Após as imunizações o sangue desses animais foi coletado e avaliada a resposta humoral do animal à proteína. A clonagem foi realizada com sucesso. As técnicas para análise de proteínas mostram que inicialmente não houve produção da proteína, então outras cepas de E. coli BL21 (DE3) foram testadas e a que melhor apresentou expressão então foi utilizada para a produção da proteína em maior escala. Ainda assim, a expressão de CD4 foi baixa. A proteína foi purificada em tampão desnaturante, visto que sua baixa solubilidade em condições nativas. A imunização posteriormente foi feita com resina contendo a proteína, sem a eluição do imunógeno. Após a última imunização, o soro dos animais foi coletado, analisado e conteve um título baixo.