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Aluno - Fernanda Pinhelli - PIBITI/CNPq - Curso de Ciências Biológicas (N) - Orientador : Emanuel Maltempi de Souza - Departamento de Bioquímica.

Título
EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE UMA LIPASE IDENTIFICADA A PARTIR DO SEQUENCIAMENTO MASSIVO DE DNA METAGENÔMICO

Área de conhecimento: 20800002 - Palavras-chave: metagenômica; bioprospecção ; enzimas - Coorientador: Rose Adele Monteiro - Colaborador: Marco Aurelio Schüler de Oliveira.

A Metagenômica permite o acesso direto ao DNA total presente em um determinado ambiente de modo independente de cultivo e tem levado a descoberta de novas enzimas com aplicações industriais. Dentre as enzimas mais investigadas destacam-se as lipases, devido a suas aplicações na produção de detergentes e biocombustíveis, obtenção de enantiômeros específicos, indústria de alimentos e farmacêutica. Durante a prospecção por lipases em uma biblioteca metagenômica construída a partir de amostras de solo da floresta atlântica foi identificado um clone com atividade lipolítica. A análise através de mutagênese com transposon e desaparecimento de fenótipo indicou que a atividade depende de dois genes: um que codifica uma proteína hipotética, possivelmente uma lipase, formando um operon com outro gene, que codifica uma provável peptidase. A lipase parece pertencer a uma nova família de enzimas, cuja atividade é dependente da peptidase. O objetivo geral deste trabalho é superexpressar e caracterizar bioquimicamente as proteínas codificadas por ambos os genes. Plasmídeos recombinantes contendo os genes codificadores da lipase e da peptidase clonados no vetor de expressão pET28a foram transformados na estirpe Escherichia coli BL21(DE3) para a superexpressão das enzimas fusionadas a cauda de histidinas. As enzimas foram purificadas através de cromatografia de afinidade em coluna com íons Ni+. O grau de pureza das enzimas foi monitorado por eletroforese em gel de poliacrilamida 12%. As enzimas purificadas foram submetidas a um ensaio de atividade de hidrólise do substrato butirato de p- nitrofenil. A atividade enzimática foi avaliada, quantificando-se o p- nitrofenil liberado, por espectrofotometria. Foi ainda realizado um ensaio de cinética de autodigestão da peptidase, também monitorada por eletroforese em gel de poliacrilamida 12%. Os resultados obtidos indicaram que a lipase possui atividade hidrolítica contra o substrato testado após ativação pela peptidase, que possui atividade auto-hidrolítica, com cerca 50% de autodigestão após 30 minutos.