CARACTERIZAÇÃO DE ISOFORMAS SOLÚVEIS DO RECEPTOR PARA PRODUTOS DE GLICAÇÃO AVANÇADA (SRAGE) EM SORO DE PACIENTES DIABÉTICOS POR WESTERN BLOTTTING

Aluno de Iniciação Científica: Karla Schoen (PIBIC/CNPq)
Curso: Medicina
Orientador: Fabiane Gomes de Moraes Rego
Co-Orientador: Mauren Isfer Anghebem-Oliveira
Colaborador: Emanuel Maltempi de Souza, Fábio Oliveira Pedrosa, Geraldo Picheth
Departamento: Patologia Médica
Setor: Ciências da Saúde
Palavras-chave: RAGE , Western Blotting , Diabetes
Área de Conhecimento: 40105008 - ANATOMIA PATOLÓGICA E PATOLOGIA CLÍNICA

O receptor para produtos de glicação avançada (RAGE) é membro da família das imunoglobulinas, é um multiligante e está associado a complicações no diabetes. Adicionalmente à isoforma ligada à membrana celular de RAGE, várias isoformas solúveis de RAGE aparecem no plasma. As isoformas solúveis de RAGE (sRAGE) resultam da clivagem por metaloproteinases (cRAGE) ou por splicing alternativo (esRAGE) e tem sido relatadas como biomarcadores para processos inflamatórios, diabetes e doença arterial coronariana. Objetivos: desenvolver e otimizar metodologia para a caracterização de isoformas solúveis de RAGE em soro utilizando western blotting (WB). Materiais e métodos: amostras de soro (n=8) de indivíduos saudáveis e diabéticos foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Os géis foram transferidos para membrana de PVDF (Amersham Hybond-P; GE Healthcare) para o WB utilizando ECL Plus Western Blotting detection system (GE Healthcare). Para a detecção das isoformas de sRAGE foram testadas 4 diferentes concentrações de anticorpo primário (IgG de coelho anti-RAGE; GE Healthcare) e uma do secundário (anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase; GE Healthcare). O padrão de migração eletroforética de aproximadamente foi comparado com o marcador de massa molecular (SpectraTM Multicolor Broad Range Protein Ladder, Fermentas). Foram identificadas três isoformas com massa molecular aparente entre 50 KDa e uma isoforma menor de aproximadamente 25 kDa. A elevada concentração de albumina no soro, é um potencial interferente na detecção de sRAGE. Para remover este interferente, as amostras foram tratadas com sulfito de sódio a 24%, na presença e ausência de álcool capróico, um agente agregador de globulinas. Resultados e Conclusões: as condições otimizadas foram: eletroforese em gel de poliacrilamida 19:1 a 10% (tampão Laemmli 1X; 200 V, 53 minutos) de soro diluído a 1:20 em salina; e WB: anticorpo primário em diluição 1:20.000; anticorpo secundário na diluição 1:4000. A albumina no soro não afetou o reconhecimento das isoformas de sRAGE pelo anticorpo primário. O pré-tratamento das amostras através da precipitação das globulinas com álcool capróico proporciona maior sensibilidade na identificação das bandas de sRAGE. Apoios: CNPq, Fundação Araucária, REUNI.

 

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