Aluno de Iniciação Científica: Laiane Lemos (IC-Voluntária)
Curso: Ciências Biológicas
Orientador: Wanderson Duarte da Rocha
Co-Orientador: Monica Mendes Kangussu-Marcolino
Colaborador: Normanda Souza Melo, Santuza Maria Ribeiro Teixeira, Patrícia Rosa de Araújo
Departamento: Bioquímica
Setor: Ciências Biológicas
Palavras-chave: amastina , função , localização
Área de Conhecimento: 21301000 - PROTOZOOLOGIA DE PARASITOS

Protozoários da família Trypanosomatidae, além de acometerem diversos organismos incluindo o homem, também despertam interesse de pesquisadores que visam entender os aspectos peculiares de sua biologia molecular e celular. A identificação e caracterização de proteínas expressas diferencialmente durante o ciclo de vida de parasitos é impulsionada pela possibilidade destas proteínas participarem da interação parasito-hospedeiro. As proteínas amastinas, inicialmente descritas como amastigotas específicas em Trypanosoma cruzi e Leishmania donovani, foram classificadas em quatro subfamílias (a, ß, ? e d), baseando-se em análises filogenéticas. Elas têm função desconhecida e estão presentes em pelo menos seis cópias em T. cruzi, nos cromossomos 26, 32 e 34, segundo dados de genoma. As pd-amastinas são encontradas em três cópias no cromossomo 34 (nomeadas pd1) alternadas por genes de tuzina, e no 26 em cópia única denominada pd2 que está acompanhada de um pseudogene de tuzina. Já as ß-amastinas estão localizadas em sequência no cromossomo 32 (ß1 e ß2). A fim de caracterizar a função destas proteínas propomos superexpressar e/ou deletar os membros da família das amastinas em T. cruzi, sendo necessária a construção de vetores específicos e posterior transfecção. Foram construídos os vetores de superexpressão: pTREX_pd2-AmaGFP, pTREX_ß1-AmaGFP e pTREX_ß2-AmaGFP, que foram transfectados e as populações transfectantes (resistentes à G418) selecionadas. Foram realizados ensaios de localização das amastinas, que nos permitiu verificar padrões de localização distintos. Outras análises, como variações nas curvas de crescimento e taxa de diferenciação, estão em andamento. Para realizar nocaute das ß-amastinas e da pd2-amastina foram construídos vetores para deleção por recombinação homóloga. Os vetores Up32PacDn32 e Up32NeoDn32, que interrompe os alelos de ambas ß-amastinas, foram digeridos, purificados e introduzidos por eletroporação em formas epimastigotas de T. cruzi. Até o momento não obtivemos sucesso na obtenção de parasitos duplo resistentes. Semelhante ao realizado para as ß-amastinas, nós construímos os vetores Up26PacDn26 e Up26NeoDn26, que conferem resistência a puromicina e neomicina, que estão em fase de preparação para introdução em formas epimastigotas. Como perspectivas, temos a transfecção de todos os cassetes destinados à deleção das ß-amastinas e da pd2-amastina, seleção de população resistente e análise de possíveis alterações fenotípicas.

0440