Aluno de Iniciação Científica: Ana Paula Cunha (PIBIC/CNPq)
Curso: Ciências Biológicas
Orientador: Wanderson Duarte da Rocha
Co-Orientador: Monica Mendes Kangussu-Marcolino
Colaborador: Emanuel Maltempi de Souza, Jean-Paul Herman, Andrea R. Ávila
Departamento: Bioquímica
Setor: Ciências Biológicas
Palavras-chave: Trypanosoma cruzi , Cre recombinase , DiCre
Área de Conhecimento: 21301000 - PROTOZOOLOGIA DE PARASITOS

O estudo de organismos causadores de doenças negligenciadas, entre elas a Doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, tem aumentado nos últimos tempos, pois tais conhecimentos auxiliam na prevenção e tratamento destas doenças. Contudo, os estudos de função gênica em T. cruzi são limitados pela ausência da maquinaria de RNAi e grande número de genes codificados por famílias multigênicas. Adicionalmente, a deleção de genes essenciais por recombinação homóloga utilizando metodologias clássicas inviabiliza a determinação da função desses genes. Diante da escassez de ferramentas para manipulação do conteúdo gênico em T.cruzi, o objetivo deste trabalho foi à avaliação de um sistema de nocaute condicional utilizando a recombinase CRE. A CRE é uma recombinase sítio-específica que catalisa a recombinação entre duas sequências LoxP para deletar, inverter ou inserir um trecho de DNA. Devido sua toxicidade intrínseca e a necessidade de uma maior regulação de sua atividade, o sistema DiCre (CRE dimerizada regulada por ligante) foi escolhido para obter nocautes condicionais em T. cruzi. Para a criação dos cassetes de expressão do sistema em ambas as espécies, as os genes que codificam as proteínas DiCre59 e DiCre60, previamente clonados em vetor pCDNA (JULLIEN et al., 2003), foram clonadas em vetor pROCK TK Hygro, gerando o plasmídio pODiCre Hygro. Para testar a atividade da DiCre em T. cruzi um segundo plasmídeo, pROCK FEKO Pur Neo, foi obtido pela transferência de um cassete contendo dois sítios LoxP flanqueando os genes de timidina quinase  e resistência a puromicina (SCAHILL et al., 2008) para vetor derivado de pROCK GFP Neo. Ambos os plasmídeos linearizados foram transfectados em formas epimastigotas de T. cruzi em diferentes combinações, sendo integrados na porção do genoma equivalente ao gene de beta-tubulina. Testes de indução pelo ligante rapamicina seguido análise por Southern blot revelaram que o sistema funciona, porém com baixa eficiência de recombinação. Uma vez que o sistema apresenta uma baixa taxa de recombinação, e que teste apontaram insensibilidade do T. cruzi a expressão do gene suicida, nós propomos estratégias alternativas para a utilização do sistema CRE/LoxP em T. cruzi que estão em fase de construção.  Suporte Financeiro: CNPq, CAPES/REUNI, Fundação Araucária.

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