UTILIZAÇÃO DE MATRIZ DE SÍLICA COMO METODOLOGIA DE EXTRAÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO PARA O DIAGNÓSTICO DO ROTAVÍRUS BOVINO GRUPO A

Aluno de Iniciação Científica: JESSICA CRISTHINE GALLEGO (PIBIC/UFPR-TN)
Curso: Medicina Veterinária - Palotina
Orientador: ELISABETE TAKIUCHI
Colaborador: Douglas Ari Burin, Andressa Fernanda Kunz, Patrícia Grolli
Departamento: Campus Palotina
Setor: Campus Palotina
Palavras-chave: rotavírus , bovino , egpa
Área de Conhecimento: 21201013 - VIROLOGIA

O rotavírus grupo A (RV gp A) é um importante enteropatógeno que determina perdas econômicas consideráveis para a exploração pecuária bovina leiteira. O genoma viral é constituído por 11 moléculas de RNA fita dupla (RNAfd), de diferentes pesos moleculares. A eleição do método de extração de ácido nucleico constitui etapa fundamental para o sucesso do diagnóstico. A extração com matriz de sílica e isotiocianato de guanidina agrega vantagens como rendimento, pureza e integridade do produto, que são fatores fundamentais para a condução de estudos moleculares futuros. O objetivo do trabalho foi utilizar a matriz de sílica em solução contendo isotiocianato de guanidina para extração do RNA viral e detecção por eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA). Foram analisadas 30 amostras fecais de bezerras (10 a 120 dias) provenientes de rebanhos leiteiros do PR. Foi preparada a suspensão fecal 10% (p/v) em tampão TRIS-Cálcio (pH 7,2), homogeneizada e centrifugada por 15´ a 2800 g. Alíquotas de 450 µL do sobrenadante foram inicialmente tratadas com tampão de (dodecil sulfato de sódio a 10%) e então submetidas em solvente orgânico (fenol/clorofórmio – álcool isoamílico); banho maria por 15´ à 56°C e posterior centrifugação. A fase aquosa foi processada com 40µL sílica e 900 µL de solução de isotiocianto de guanidina acrescido de Triton (L6) durante 30´ para adsorção do ácido nucléico. As amostras foram centrifugadas a 10.000 g. por 30´´, desprezando sobrenadante por inversão, seguindo-se a etapa de adição de 500 µL solução L2 (isotiocianato de guanidina); centrifugação e descarte. Após etapas sucessivas de lavagem dos pellets de sílica com etanol 70% e acetona, foi adicionada água ultra pura, seguida de imersão em banho-maria à 56ºC durante 15´ para eluição do ácido nucléico. Após centrifugação, o sobrenadante foi recolhido em um novo microtubo. As amostras extraídas foram submetidas à EGPA a 7,5% e coradas com nitrato de prata. Das 30 amostras analisadas, foi possível a identificação do RVgp A em oito delas. Entre as qualidades do sal tiocianato de guanidina estão o potencial desnaturante, forte inibidor das ribonucleases e capacidade de recuperar em grande quantidade e pureza RNA total a partir de pequenas quantidades de tecidos ou células. Uma vez que estudos moleculares (caracterização genotípica) das amostras positivas estão previstos na continuidade do projeto, a metodologia utilizada mostrou-se satisfatória e vantajosa para o objetivo e perspectivas futuras.

 

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