CONSTRUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ISCA CORRESPONDENTE À PROTEÍNA PRÍON CELULAR (PRPC)
Aluno de Iniciação Científica: Mariana Campos Atherino (PIBIC/CNPq)
Curso: Farmácia
Orientador: Adriana Frohlich Mercadante
Co-Orientador: Breno Castello Branco Beirão
Colaborador: Ana Paula Lappas Giménez, Celso Fávaro Júnior, Evelyn Castillo Lima
Departamento: Patologia Básica
Setor: Ciências Biológicas
Palavras-chave: Proteína Príon Celular , Epitélio Olfatório , Duplo Híbrido
Área de Conhecimento: 20804008 - BIOLOGIA MOLECULAR
O sistema olfatório consiste basicamente de neurônios sensoriais presentes no epitélio nasal, de neurônios de segunda ordem e de interneurônios presentes no bulbo, responsáveis por enviar a informação sensorial para os tratos encefálicos superiores. Já foi demonstrado que a proteína príon celular (PrPc) é importante na discriminação de odorantes, provavelmente por mediar interações das células no bulbo. PrPc é uma glicoproteína de 33-35 kDa ligada à membrana através de uma âncora de glicosilfosfatidilinusitol (GPI). Está presente em diversos tecidos, sendo encontrada com maior abundância nas células do sitema nervoso. Uma modificação conformacional de PrPc para sua isoforma patogênica (PrPSc) é responsável pelas encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSE), em que há um depósito dessa proteína nas células do sistema olfatório. Como pouco se conhece sobre as funções de PrPc, seu entendimento pode ajudar a elucidar seus mecanismos moleculares, bem como a transmissão das doenças relacionadas. Uma possível estratégia para tanto é a busca de parceiros moleculares de PrPc. Para dar início a busca pelos ligantes utilizando o sistema duplo-híbrido em leveduras, foi construída uma isca correspondente à PrPc em vetor pGILDA. Pretende-se utilizar essa isca para varredura de biblioteca de cDNA de epitélio olfatório (já disponível no laboratório). A partir de um plasmídeo pré-existente, contendo a sequencia correspondente ao PrPc 23-231, foram desenvolvidos oligonucleotídeos iniciadores para a amplificação do inserto. A esses iniciadores foram adicionados sítios de restrição para enzimas Eco RI e Bam HI, avaliados e selecionados com base na sequencia de PrPc após consulta ao programa NEB Cutter e ao sítio de multiclonagem(MCS) do vetor pGILDA. Após realização da reação em cadeia da polimerase (PCR), o inserto PrPc foi digerido com as enzimas Eco RI e Bam HI. O vetor pGILDA foi digerido com as mesmas enzimas. Procedeu-se a reação de ligação e a transformação em E. coli DH5a. Colônias contendo o inserto foram selecionadas, seus plasmídeos purificados e a construção foi positivamente validada pelo método da dupla digestão e sequenciamento. A isca foi então transformada em leveduras RFY 206 e sua expressão foi confirmada por Western blot. Realizou-se também o teste de autoativação e verificou-se que a isca correspondente a PrPc não foi capaz de autoativar os genes repórteres e, portanto, poderá ser utilizada nas varreduras pretendidas. O projeto foi financiado pelo CNPq.