Aluno de Iniciação Científica: Isabela Tiemy Pereira (PIBIC/CNPq)
Curso: Ciências Biológicas
Orientador: Giseli Klassen
Co-Orientador: Karin Braun-Prado
Colaborador: Edneia A. S. R.Cavalieri, Graciele C. M. Manica, Liliane M. B. Klassen
Departamento: Patologia Básica
Setor: Ciências Biológicas
Palavras-chave: câncer de mama , epigenética , MMP2
Área de Conhecimento: 20804008 - BIOLOGIA MOLECULAR

O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais frequente no mundo e a principal causa de morte entre as mulheres. Alterações na regulação da expressão gênica por eventos epigenéticos são mecanismos comuns neste tipo de câncer. MMP2 é uma metaloprotease capaz de degradar o colágeno tipo IV, um dos principais constituintes da matriz extracelular, esta enzima é reconhecida por atuar no mecanismo de metásteses em diversos tipos de câncer. Estudos recentes demonstraram que o gene MMP2 pode ser regulado por metilação do DNA em linhagem tumoral de mama MCF-7. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo aprimorar o estudo do perfil de metilação do promotor do gene MMP2 em linhagens tumorais de mama e em tumores primários de mama utilizando a técnica de MSP (methylation specific PCR). Para isso, amostras de DNA foram isoladas das linhagens tumorais MDA-MB 231, MCF-7 e HB4a (linhagem normal). O DNA das amostras foi tratado com bissulfito de sódio que modifica as citosinas não metiladas que são convertidas a timinas após a reação de PCR, enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas. As ilhas de CpG do promotor do gene MMP2 das linhagens foram então amplificadas por PCR (fragmento de 383 pb), purificadas em gel de agarose 1% e ligadas ao vetor pGEMT®easy. Os produtos foram eletroporados em estirpe de E. coli DH10B e pelo menos oito clones recombinantes foram selecionados por a-complementação. O DNA plasmidial foi extraído e sequenciado, permitindo observar que a linhagem normal HB4a, que expressa o gene MMP2, apresentou 18,1% de metilação global. As linhagens tumorais que não expressam MMP2, MCF7 e MDA-MB-231, mostraram 87,7% e 81,1% de metilação global respectivamente. O perfil de metilação das linhagens tumorais permitiu planejar a localização dos iniciadores para a técnica de MSP capazes de distinguir as amostras metiladas das não metiladas. Nesse momento está sendo feita a padronização dos iniciadores de MSP para uso em tumores primários de mama. Concomitantemente, o promotor de gene MMP2 está sendo clonado e sequenciado de amostras de tumores primários de mama para a análise do perfil de metilação tumoral. Os resultados de sequenciamento obtidos da linhagem normal de mama HB4a, que expressa MMP2, e MDA-MB-231, que não expressa o gene, são novos e vem, portanto, acrescentar dados sobre os mecanismos epigenéticos de regulação da expressão gênica por metilação do DNA em câncer de mama. Suporte financeiro: CNPq, CAPES, Fundação Araucária, UFPR-PIBIC.

 

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