Aluno de Iniciação Científica: Andressa Chequin (PIBIC/Fundação Araucária)
Curso: Ciências Biológicas
Orientador: Karin Braun-Prado
Co-Orientador: Giseli Klassen
Colaborador: Edneia A. S. R.Cavalieri, Graciele C. M. Manica, Liliane M. B. Klassen
Departamento: Patologia Básica
Setor: Ciências Biológicas
Palavras-chave: Rinite Alérgica , Epigenética , Técnica MSAP-PCR
Área de Conhecimento: 20804008 - BIOLOGIA MOLECULAR

A metilação de ilhas CpG do DNA é uma importante forma de regular a expressão de genes, podendo, inclusive, colaborar com o aparecimento de doenças autoimunes, como a rinite alérgica. Por se tratar de uma doença complexa (causas genéticas e epigenéticas), não há ainda um completo entendimento sobre seu funcionamento e nem formas eficazes de minimizar os efeitos colaterais de seus tratamentos, de maneira que projetos que contribuam para uma melhor compreensão desta são necessários. Uma das formas de caracterização do perfil de metilação é através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase realizado com Iniciadores Aleatórios Sensíveis à Metilação (MSAP-PCR). Esta técnica permite a diferenciação entre padrões de metilação presentes em controles sadios e em pacientes com rinite alérgica através uma análise global do genoma. Previamente nosso grupo no laboratório de Epigenética da UFPR identificou polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) no lócus IL4-IL13 e dando continuidade ao estudo caso-controle na rinite alérgica foi padronizada a técnica de MSAP-PCR. Para padronização, inicialmente foram utilizadas amostras de DNA obtidas a partir de 20 ml de sangue periférico de dois indivíduos considerados controle e caso (com rinite). Após a obtenção do DNA através da técnica de fenol/clorofórmio, utilizou-se 0,8 µg de DNA para restrição enzimática com cada uma das enzimas: MspI e HpaII (isoesquizômero de MspI, sensível a metilação). Em seguida foram realizadas PCR para amplificação dos genes MLH1 e P53 para verificar a eficácia da digestão e a integridade do DNA digerido, respectivamente. Após essa etapa, procedeu-se a execução da técnica de MSAP-PCR com o uso do par de primers MGC0/MGF2 e do primer simples MLG2. Para visualização das amplificações foram realizadas corridas eletroforéticas a 200V em géis de poliacrilamida 8% por 4 horas à 4°C. Após padronização das quantidades de enzimas de restrição, tempos e temperaturas de anelamento nas PCRs, quantidade de poliacrilamida e tempos de corrida nos géis, foi observada a presença de uma banda de DNA de aproximadamente 350pb obtida na PCR com o par de primers MGC0/MGF2 metilada na amostra do DNA controle. Segue-se agora a confirmação desse perfil distinto entre pacientes e controles com mais amostras de DNA, obtidas de indivíduos sadios e com rinite para posterior clonagem e caracterização da sequência de nucleotídeos para caracterização do gene diferencialmente metilado na rinite alérgica. Suporte financeiro: CNPq, CAPES, Fundação Araucária, UFPR-PIBIC.

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