Aluno de Iniciação Científica: Rafaela Barbirato Ferreira (CNPq-Balcão)
Curso: Informatica Biomédica
Orientador: Emanuel Maltempi de Souza
Co-Orientador: Helisson Faoro, Maria Berenice R. Steffens
Colaborador: Vânia Carla Silva Pankievicz, Rose Adele Monteiro, Fábio de Oliveira Pedrosa
Departamento: Bioquímica
Setor: Ciências Biológicas
Palavras-chave: Bioprospecção , Metagenômica , Lipase
Área de Conhecimento: 20802005 - BIOQUÍMICA DOS MICROORGANISMOS

O recente progresso na área da metagenômica permitiu a descoberta de uma grande diversidade de enzimas com características interessantes para o campo da Biotecnologia como esteroseletividade, enantioseletividade, atividade em solventes orgânicos e a altas temperaturas. Em particular, as enzimas hidrolíticas são as mais investigadas e, entre elas, as lipases, devido à sua variabilidade e aplicação em diversos campos da indústria. Elas catalisam a hidrólise de acilgliceróis de cadeia longa formando ácidos graxos livres e glicerol. Seu mecanismo catalítico é baseado no mecanismo proposto para proteases, devido à semelhança estrutural entre o sítio ativo das mesmas: presença da tríade catalítica, composta por serina, histidina, aspartato/glutamato. O nível elevado de produção de lipases microbianas requer não somente a superexpressão eficiente dos genes equivalentes, mas também uma compreensão minuciosa dos mecanismos moleculares que regulam a sua dobra, secreção e atividade. As lipases, ou triacilglicerol hidrolases são classificadas em oito famílias, de acordo com sua sequência e propriedades bioquímicas. A partir da triagem que foi feita em uma biblioteca metagenômica construída a partir do DNA extraído de amostras de solo da Floresta Atlântica Paranaense, foi identificada uma nova família de lipases denominada LipAP (Activated by Proteolysis), cuja principal característica é a dependência de uma protease para a sua ativação. Entretanto, a relação molecular entre a lipase e a protease e as características bioquímicas dessa nova família de lipases não foram determinadas, sendo esse o objetivo desse trabalho. Para tanto, as duas proteínas foram superexpressas a partir do vetor pET28a, purificadas e utilizadas em ensaios in vitro para determinação da relação lipase/protease. Em seguida, a lipase ativada será caracterizada bioquimicamente em relação à temperatura e ph ótimos, estabilidade em diferentes temperaturas e ph, e atividade em metais e detergentes. Na primeira etapa do trabalho os clones em vetor pET28a contendo os genes da lipase lipAP e a peptidase foram confirmados por restrição. A clonagem do gene lipAP no vetor pT7-7 também foi confirmada e permitirá ensaios de co-expressão. Esses plasmídeos foram transformados na estirpe Rosetta de E. coli para ensaios de superexpressão. A análise dos géis indicou que as proteínas estão sendo expressas corretamente com os tamanhos esperados, permitindo, como próximo passo, a determinação das melhores condições de expressão para obtenção de proteínas solúveis.

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