MOBILIZAÇÃO DE POLIHIDRÓXIBUTIRATO EM HERBASPIRILLUM SEROPEDICAE SMR1
Aluno de Iniciação Científica: Fernanda Holthmam (PIBIC/UFPR-TN)
Curso: Farmácia
Orientador: Marcelo Müller dos Santos
Co-Orientador: Cícero Silvano Teixeira
Colaborador: Fabio de Oliveira Pedrosa, Emanuel Maltempi de Souza
Departamento: Bioquímica
Setor: Ciências Biológicas
Palavras-chave: Herbaspirillum seropedicae , Polihidroxibutirato , PHB depolimerases
Área de Conhecimento: 20802005 - BIOQUÍMICA DOS MICROORGANISMOS
Herbaspirillum seropedicae é um diazotrofo endofítico capaz de produzir e armazenar o poliéster polihidróxibutirato (PHB) na forma de grânulos intracelulares. Este polímero atua como reserva de carbono e também de potencial redutor. No genoma de H. seropedicae SmR1foram encontrados 13 genes potencialmente envolvidos com a síntese e a degradação de PHB. Entre eles, dois genes denominados phaZ1 e phaZ2 codificam prováveis PHB depolimerases, hidrolases envolvidas na degradação de PHB. A fim de entender como ocorre a mobilização dos grânulos de PHB em H. seropedicae, o objetivo deste projeto é construir estirpes mutantes dos genes phaZ1 e phaZ2, aplicando a técnica de deleção em fase e avaliar a capacidade destas estirpes em mobilizar o PHB intracelular. Como parte da estratégia experimental, as regiões 500 pb a montante e a jusante dos genes phaZ1 e phaZ2 de H. seropedicae são amplificadas por PCR, clonadas em vetor do tipo T/A e sequenciadas usando dideoxinuclotídeos fluorescentes. Após o sequenciamento, os dois fragmentos são subclonados no plasmídeo pK18mobsacB. Este vetor pode ser conjugado de E. coli para H. seropedicae, porém não é replicado nesta bactéria, fazendo com que o plasmídeo seja integrado ao cromossomo por recombinação homóloga através das regiões a montante ou a jusante dos genes alvo. Os recombinantes são selecionados por sensibilidade a sacarose e resistência a canamicina. As colônias de H. seropedicae que apresentam apenas a cópia deletada do gene alvo são selecionadas por análise de PCR. As estirpes selvagem de H. seropedicae SmR1 e mutantes phaZ1 e phaZ2 serão avaliadas quanto a capacidade de mobilizar PHB em condições de baixa disponibilidade de carbono no meio de cultivo, e também, de sobrevivência em meio de cultivo sem carbono. Até o momento, os fragmentos a montante e a jusante do gene phaZ1 foram amplificados por PCR, clonados no vetor pCR2.1 e sequenciados. A sequência confirmou 100% de identidade dos produtos de PCR obtidos, com as regiões a montante e a jusante do gene phaZ1 de H. seropedicae. Para obter um produto de deleção que possa ser subclonado no plasmídeo pK18mobsacB, os fragmentos de phaZ1 foram subclonados em pUC19. O produto de deleção do gene phaZ1 será subclonado em pK18mobsacB para se iniciar a seleção do mutante ?phaZ1.