Aluno de Iniciação Científica: Henrique Petry Feiler (PIBIC/CNPq)
Curso: Agronomia
Orientador: Rose Adele Monteiro
Co-Orientador: Emanuel Maltempi de Souza
Colaborador: Adriano Stefanello, Marco Aurelio de Oliveira, Leda Satie Chubatsu
Departamento: Bioquímica
Setor: Ciências Biológicas
Palavras-chave: NifA , Herbaspirillum seropedicae , Fixação de Nitrogenio
Área de Conhecimento: 20801017 - PROTEÍNAS

Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria diazotrófica encontrada em associação endofítica com gramíneas de interesse econômico, como milho e cana-de-açúcar. Nesse organismo, a transcrição dos genes nif (que codificam os genes necessários para a fixação biológica do nitrogênio) é regulada pelo ativador transcricional NifA, uma proteína que possui três domínios modulares e é regulada negativamente por altas concentrações de amônio e oxigênio. A regulação por amônio é atribuída ao domínio N-terminal, que não é essencial para a atividade da proteína; já a sensibilidade a oxigênio é inerente ao domínio central e ao interdomínio que conecta os domínios central e C-terminal, sendo creditada a um motivo conservado de 4 cisteínas que poderia abrigar um cluster de ferro-enxofre. A presença de um cluster desse tipo é sugerida por evidências in vivo, mas jamais foi demonstrada e caracterizada in vitro. Neste trabalho, foi feita a otimização da expressão e da purificação de uma variante N-truncada da proteína NifA de H. seropedicae, denominada HisN185, com vistas à obtenção dessa proteína purificada contendo o cluster de ferro-enxofre formado para caracterização. Foram determinados protocolos eficientes para a purificação de HisN185 em atmosfera oxidante e atmosfera inerte, e foram feitos experimentos preliminares para mostrar sua interação específica com DNA e a presença do cluster de ferro-enxofre. Os resultados dos ensaios de alteração de mobilidade eletroforética (EMSA) mostraram que não há diferença na interação de HisN185 purificada em condições oxidantes ou inertes com DNA. Ensaios de varredura de espectro de luz visível sugeriram que a proteína purificada em anaerobiose possui baixo conteúdo do possível cluster de ferro-enxofre. Novos experimentos de otimização de expressão se fazem necessários para a obtenção de uma amostra de proteína mais enriquecida com cluster de ferro-enxofre.

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