ATIVIDADE DA FOSFOLIPASE-D DO VENENO DE L. INTERMEDIA EM CULTIVO CELULAR: EFEITOS DE ATIVAÇÃO ENDOTELIAL E PRÓ-COAGULANTE.
Aluno de Iniciação Científica: Mariana Gabriel Magnoni (PIBIC/Fundação Araucária)
Curso: Farmácia
Orientador: Silvio Sanches Veiga
Co-Orientador: Olga Meiri Chaim
Colaborador: Luiza Helena Gremski
Departamento: Biologia Celular
Setor: Ciências Biológicas
Palavras-chave: aranha-marrom , fosfolipase-D , ativação endotelial
Área de Conhecimento: 20601000 - CITOLOGIA E BIOLOGIA CELULAR

As aranhas-marrons (gênero Loxosceles), são responsáveis pelo envenenamento  denominado loxoscelismo. O veneno destas aranhas é composto por uma mistura de toxinas, principalmente enzimas e peptídeos. As fosfolipases-D são reportadas como uma família de toxinas dermonecróticas, isoladamente capazes de reproduzir a lesão dermonecrótica, induzir hemólise, aumentar a permeabilidade vascular e, em especial, disparar uma resposta inflamatória local e sistêmica exacerbada. Diversas isoformas de fosfolipases-D de L. intermedia já foram identificadas e clonadas, a partir de uma biblioteca de cDNA da glândula produtora de veneno, em sua forma recombinante (LiRecDTs) são potentes moléculas bioativas. Os aminoácidos do sítio catalítico das fosfolipases-D são conservados nas seis isoformas descritas. Entretanto, há diferença entre a atividade fosfolipásica das isoformas. A mutação sítio-dirigida substituiu a histidina 12 do sítio por alanina produzindo uma isoforma mutada (LiRecDT1H12A) que possui atividade radicalmente reduzida. As fosfolipases-D geram metabólitos derivados de sua atividade enzimática sobre a membrana de células. O ácido lisofosfatídico (LPA) é liberado quando o substrato desta enzima é um lisofosfolipídio. Mediadores lipídicos estão envolvidos em vários eventos celulares, sendo o LPA capaz de estimular adesão de eritrócitos sobre a superfície de células endoteliais. O trabalho objetivou avaliar o comportamento de eritrócitos expostos às fosfolipases-D recombinantes relacionadas com a ativação das células endoteliais, do ponto de vista funcional e morfológico. As isoformas foram expressas em E.coli BL21(DE3)pLysS, contendo etiqueta de 6 histidinas n-terminal para purificação por cromatrografia de afinidade em Ni-NTA agarose e a pureza foi verificada em gel de SDS-PAGE 12,5%. Foram realizados ensaios com linhagem celular de aorta de coelho em cultura (RAEC), incubando-as com eritrócitos humanos previamente expostos a LPA, LiRecDT1, veneno bruto e LiRecDT1H12A, separadamente. Observou-se aumento da adesão de eritrócitos expostos a LiRecDT1 às células RAEC, suportando a hipótese de que os eritrócitos expostos a fosfolipase-D recombinante do veneno de L. intermedia, podem estar sendo induzidos a liberar lipídios bioativos capazes de levar os eritrócitos a se ligarem às RAECs. Os resultados apontam que lipídios bioativos gerados pela atividade fosfolipásica influenciam na atividade do endotélio e sua relação com os eritrócitos, podendo estar relacionada ao processo inflamatório e distúrbios hematológicos observados no envenenamento com aranha-marrom.

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