Aluno de Iniciação Científica: lucas pedrosa da silva (Pesquisa voluntária)
Curso: Farmácia
Orientador: Silvio sanches veiga
Co-Orientador: Olga Chaim
Colaborador: Marianna Boia, Adriano Morgon
Departamento: Biologia Celular
Setor: Ciências Biológicas
Palavras-chave: LALP , veneno , metaloprotease
Área de Conhecimento: 20601000 - CITOLOGIA E BIOLOGIA CELULAR

Aranhas do gênero Loxosceles (aranhas-marrons) produzem veneno composto por diversas toxinas, entre elas proteínas, responsáveis pelo quadro conhecido como loxoscelismo, que se manifesta em sintomas cutâneos e/ou sistêmicos. O quadro cutâneo é o mais comum e pode levar ao desenvolvimento de uma lesão necrótica com espalhamento gravitacional. O quadro viscerocutâneo pode envolver distúrbios da hemostase, bem como manifestações sistêmicas que podem evoluir para uma insuficiência renal aguda. No veneno de Loxosceles intermedia foram identificadas metaloproteases da família da astacinas denominadas LALPs (Loxosceles Astacin-Like Metalloproteases). Essas enzimas atuam degradando componentes da matriz extracelular e possivelmente facilitam também a penetração de outros componentes do veneno. Na biblioteca de  cDNA da glândula de veneno de L. intermedia foi identificada uma sequência que codifica uma nova isoforma de metaloprotease da família das astacinas, denoninada LALP3. Análises da sequência aminoacídica da LALP3 revelaram que a proteína madura apresenta 200 resíduos de aminoácidos, peso molecular de 23,2kDA e PI 9,88, além de sítios de N-Glicosilação e 4 resíduos de cisteínas, logo acrescentando possivelmente 2 pontes dissulfeto. O alinhamento da LALP3 com outras metaloproteases do tipo astacina de L. intermedia revelou 46% de homologia com a LALP1 e a presença das assinaturas da família das astacinas (HEXXHXXGXXHE e MXY). Nesse estudo foi realizada a clonagem do cDNA que codifica a LALP3 em vetor de expressão pET-SUMO, com o objetivo de obtê-la solúvel e ativa. Para os testes de expressão foi utilizada a cepa E. coli SHuffle T7 Express lysY nas seguintes condições: 0.05 mM, 0.1 mM, 0.5mM, 1mM e 2mM IPTG à 30°C por 4 horas. A melhor condição observada nos testes de expressão (1mM IPTG) foi utilizada para expressão em larga escala. Por meio de um ensaio de Western Blot, utilizando anticorpos específicos que detectaram a presença da etiqueta de histidina, confirmou-se a presença da LALP3 recombinante no estado solúvel. A LALP3 recombinante foi expressa fusionada a um His-Tag, o que irá proporcionar a purificação por cromatografia em resina Ni-NTA agarose. Nesse momento estamos realizando os ensaios de purificação a fim de se obter a enzima pura para posteriores ensaios bioquímicos e biológicos. A obtenção e caracterização funcional das LALPs abre a perspectiva de utilizá-las como bioferramentas no diagnóstico e tratamento clínico decorrente do loxoscelismo, além de outras aplicações biotecnológicas.

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