Aluno de Iniciação Científica: Kiane Freitas da Silva (PIBIC/Fundação Araucária)
Curso: Farmácia
Orientador: Waldemiro Gremski
Co-Orientador: Silvio Sanches Veiga
Colaborador: Dilza Trevisan Silva, Luiza Helena Gremski, Valéria Pereira Ferrer
Departamento: Biologia Celular
Setor: Ciências Biológicas
Palavras-chave: Astacinas , Aranha-marrom , Loxosceles
Área de Conhecimento: 20601000 - CITOLOGIA E BIOLOGIA CELULAR

As aranhas do gênero Loxosceles, conhecidas como aranhas-marrons, são responsáveis por acidentes de importância clínica para a saúde pública no Estado do Paraná. O veneno é composto principalmente por proteínas e seu estudo é de grande importância para compreender seus mecanismos de ação, caracterizá-lo e utilizar seus componentes em possíveis aplicações biotecnológicas. As metaloproteases do tipo astacinas (LALP-Loxosceles astacin-like protease) são uma família de enzimas presentes no veneno que podem estar relacionadas com distúrbios hemostáticos e com o espalhamento das demais toxinas devido à sua ação de degradação dos componentes da matriz extracelular. A obtenção de astacinas recombinantes solúveis e ativas é o principal objetivo do presente estudo. Inicialmente, a construção LALP2/pPICZaA para expressão em P.pastoris foi utilizada para  transformação de células quimicamente competentes de E.coli cepa TOP10F’. Dois clones (5 e 20) dentre os obtidos na transformação foram escolhidos para a purificação da construção referida e seu sequenciamento mostrou que a construção estava em fase de leitura e sem trocas de nucleotídeos. Para transformação em P.pastoris, essa construção foi linearizada com enzima SacI e células de levedura foram preparadas pelo método de sorbitol. Tal método não foi satisfatório, pois não foram obtidas colônias após a transformação por eletroporação. Novos protocolos serão testados para transformação de leveduras quimicamente competentes com kits comerciais. Como alternativa para obter a proteína de interesse solúvel e ativa, foi realizada superexpressão da LALP1 em E.coli BL21(DE3)pLys-S para obtenção da proteína insolúvel em corpos de inclusão, os quais foram solubilizados em tampão fosfato com uréia e utilizados em ensaios de refolding in vitro em coluna. Para tanto, a ligação da proteína na resina Ni-NTA agarose foi realizada em condições desnaturantes, no momento da lavagem da coluna foram passados lentamente vários tampões com concentrações decrescentes de uréia e/ou DTT e a eluição foi feita em condições nativas e dialisada em PBS1x. As amostras purificadas foram analisadas em SDS-PAGE e a atividade foi testada em ensaios de degradação de fibronectina, fibrinogênio e gelatina. Até o momento os ensaios de redobramento foram eficientes para solubilidade mas não para atividade. Posteriormente será realizado o método de refolding por diluição rápida e os mesmos ensaios serão realizados com a LALP2. Obtendo as LALPs ativas, sua caracterização in vitro e in vivo poderá ser realizada, assim como prospecções biotecnológicas. 

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