Aluno de Iniciação Científica: Eduardo Mendonça Soares (PIBIC/CNPq)
Curso: Farmácia
Orientador: Walderimo Gremski
Co-Orientador: Silvio Sanches Veiga
Colaborador: Gabriel Otto Meissner, Luiza Helena Gremski, Profa Dra.Olga Meiri Chaim
Departamento: Biologia Celular
Setor: Ciências Biológicas
Palavras-chave: Loxosceles intermédia , toxina , expressão heteróloga
Área de Conhecimento: 20601000 - CITOLOGIA E BIOLOGIA CELULAR

A grande incidência de aranhas-marrons (gênero Loxosceles) no Estado do Paraná, predominantemente em Curitiba e Região Metropolitana, é de grande preocupação devido às complicações clínicas decorrentes da picada dessas aranhas. Tais complicações consistem em quadro clínico local e/ou sistêmico, denominado loxoscelismo. O veneno da aranha-marrom trata-se de uma complexa mistura de toxinas, dentre elas: fosfolipases-D, hialuronidase, metaloproteases e toxinas potencialmente inseticidas. O grande empecilho no estudo é a obtenção de quantidades suficientes purificadas das toxinas isoladas a partir do veneno total, para fins de estudos bioquímicos e biológicos. Para tal, técnicas em biologia molecular permitem a purificação de grandes quantidades das toxinas através de clonagem e expressão em cepas bacterianas. O objetivo deste trabalho é a clonagem e a padronização da expressão heteróloga de uma toxina potencialmente inseticida presente no veneno da aranha-marrom, identificada no transcriptoma da glândula de veneno, denominada NTX. Essa toxina pertence a família das notinas que é uma família estrutural de peptídeos ricos em resíduos de cisteína. A sequência codificante para a toxina NTX foi obtida a partir do transcriptoma da glândula de veneno através da técnica de PCR utilizando oligonucleotídios iniciadores específicos que continham sítios de restrição para as enzimas BamH I e Xho I. A clonagem foi realizada em vetor de expressão pET-32a, que proporciona uma tioredoxina fusionada ao peptídeo de interesse a fim de melhorar a formação de pontes dissulfeto em bactérias. A construção obtida na clonagem foi transformada para cepa de expressão de E. coli, BL21 (DE3) STAR. A partir desta transformação, a expressão foi induzida com indutor IPTG a 0,1mM, em 4 horas à 30oC. Amostras referentes aos tempos de expressão foram coletadas, de hora em hora, para posterior análise. A cultura final foi centrifugada e as células foram resuspendidas em tampão fosfato. Estas células foram lisadas por sonicação em oito ciclos de 20s cada. A expressão e a solubilidade da toxina foram analisadas por gel SDS-PAGE 18% e corado com azul brilhante de coomansie. A cepa BL21(DE3)STAR se mostrou eficiente na expressão da NTX, na condição avaliada. O vetor pET-32a permitiu a produção da toxina na forma solúvel, mas devido ao grande número de cisteínas, a toxina produzida apresentava-se agregada a outras proteínas bacterianas. A obtenção da NTX ativa possibilitará o seu uso como ferramenta biotecnológica pra estudos em Biologia Celular e Eletrofisiologia.

0289