TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE EXPLANTES COTILEDONARES DE EUCALYPTUS SALIGNA SM. VIA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
Aluno de Iniciação Científica: Laís Gomes Adamuchio (PIBIC/CNPq)
Curso: Agronomia
Orientador: Marguerite Quoirin
Co-Orientador: Yohana de Oliveira
Departamento: Botânica
Setor: Ciências Biológicas
Palavras-chave: Estresse abiótico , resistência ao frio , espécie florestal
Área de Conhecimento: 20303009 - FISIOLOGIA VEGETAL
Eucalyptus saligna possui como principal limitação ao cultivo a intolerância a geadas. A superexpressão do gene P5CS é uma alternativa para a resolução deste problema, pois este gene regula a síntese da prolina, envolvida com a resistência a este tipo de estresse. O objetivo deste trabalho foi obter plantas transformadas com P5CS a partir de explantes co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens. Dois experimentos foram realizados. O primeiro visa a comparar a eficiência da organogênese indireta em 4 genótipos e o segundo avaliar 3 tipos de explantes na transformação. No primeiro experimento foram utilizadas folhas de 4 genótipos cultivados em meio MSM (MS com metade da concentração de nitratos) adicionado de 0,1 µM ANA + 1,0 µM TDZ para formação de calos e a seguir, de 0,67 µM ANA + 1,1 µM BAP para regeneração de gemas. O experimento foi repetido duas vezes. A cada 15 dias foram avaliados porcentagens de oxidação, formação de calo e regeneração de gemas. O genótipo G3 apresentou-se mais eficiente, diferindo estatisticamente dos demais, com maior número de gemas por explante (0,38). No segundo experimento foram comparados explantes foliares do G3, 30 e 120 dias após a regeneração por organogênese indireta e de folhas cotiledonares (vários genótipos). Os explantes foram cortados em água estéril e mantidos por 30 min numa suspensão da cepa EHA 105 de A. tumefaciens contendo os genes P5CS, gus e nptII. Os explantes foram mantidos na co-cultura sólida por 5 dias em meio MS + 4.44µM BAP + 2,69µM ANA para cotilédones ou meio MSM adicionado de 0,1 µM ANA e 1,0 µM TDZ para segmentos foliares e em seguida transferidos para o mesmo meio contendo Cefotaxima e Km. Paralelamente explantes dos 3 tipos não inoculados com a bactéria foram cultivados nos mesmos meios, sem antibióticos. Após a regeneração de brotos, foi realizado o teste histoquímico da ß-glucuronidase para verificar a expressão do gene gus. O experimento foi repetido duas vezes. As folhas de 120 dias, transformadas e controle, apresentaram menor oxidação (19%) e maior formação de calos (80%). As folhas cotiledonares não transformadas apresentaram maior regeneração de gemas (13,75%) e número de gemas por explante (4,22). Observou-se a expressão transiente do gene gus em 37,9% dos explantes sugerindo a transformação transiente dos tecidos vegetais, sem diferença estatística entre os tratamentos. Foram obtidas 3 brotações regeneradas a partir de 3 folhas cotiledonares. Para a comprovação da tranformação estável, análises moleculares do material putativo serão realizadas.