Aluno de Iniciação Científica: Karen Ishii Marcondes Ribas (PIBIC/Fundação Araucária)
Curso: Farmácia
Orientador: Ana Claudia Bonatto
Co-Orientador: Roseli Wassen
Departamento: Genética
Setor: Ciências Biológicas
Palavras-chave: Rhizobium sp. NGR234 , Sistema Ntr , Metabolismo de Nitrogênio
Área de Conhecimento: 20202008 - GENÉTICA MOLECULAR E DE MICROORGANISMOS

Em proteobactérias, o metabolismo de nitrogênio é controlado pelo sistema Ntr, um sistema que monitora e responde aos níveis de nitrogênio, carbono e energia da célula. Em baixos níveis de amônio, o sistema Ntr pode ativar vias alternativas de utilização de nitrogênio, como a fixação de nitrogênio atmosférico. Entre as proteínas que compõem o sistema Ntr está o sistema de dois componentes NtrB-NtrC, no qual a proteína NtrB controla a atividade da proteína NtrC em resposta aos níveis de nitrogênio intracelular. Quando estes níveis estão baixos, NtrB fosforila NtrC que atua como ativador transcricional de genes e operons envolvidos com o metabolismo de nitrogênio. Alguns organismos também possuem outro sistema formado pelas proteínas NtrY e NtrX, onde NtrY é a proteína sensora com atividade de quinase e NtrX a proteína reguladora de resposta. A função destas proteínas ainda é pouco compreendida, sendo que em alguns organismos parecem estar envolvidas com o metabolismo de nitrato. Rhizobium sp NGR234 é uma a-Proteobacteria fixadora de nitrogênio capaz de estabelecer relação simbiótica com diversos gêneros de legumes. O objetivo deste trabalho é clonar e mutagenizar o gene ntrX de Rhizobium sp NGR234 para estudar a função do par NtrY-NtrX neste organismo. A sequência do gene ntrX de Rhizobium sp. NGR234 foi obtida a partir da sequência genômica deste organismo e utilizada no planejamento de primers específicos. Um fragmento de aproximadamente 1400 pb foi amplificado a partir do DNA genômico de NGR234 e confirmado por eletroforese em gel de ágar 1,2%. Este fragmento foi ligado ao vetor pTZ57R/T e a ligação transformada em células de Escherichia coli estirpe DH10B. Os clones obtidos foram submetidos ao sequenciamento para confirmar a integridade da sequência do gene ntrX e o plasmídeo construído foi denominado ntrXpTZ57. Esta construção foi digerida com a enzima EcoRV, liberando um fragmento interno do gene ntrX de 909 pb. O fragmento restante foi ligado e transformado em células de E. coli DH10B. O plasmídeo resultante, que possui o gene ntrX truncado, foi denominado de ntrXDELpTZ57. Esta construção será utilizada para a obtenção de uma estirpe mutante ntrX- de NGR234.

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