CONSTRUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ISCA CORRESPONDENTE AO DOMÍNIO CITOPLASMÁTICO DE SEMAFORINA 5A

Aluno de Iniciação Científica: Leonardo Puchetti Polak (PIBIC/Fundação Araucária)
Curso: Ciências Biológicas
Orientador: Adriana Frohlich Mercadante
Co-Orientador: Celso Fávaro Junior
Colaborador: Ana Paula Gimenez, Evelyn Castillo Lima, Silvio Marques Zanata
Departamento: Patologia Básica
Setor: Ciências Biológicas
Palavras-chave: semaforina 5B , duplo-híbrido em leveduras , epitélio olfatório
Área de Conhecimento: 20000006 - CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

O desenvolvimento do sistema nervoso é um processo extremamente complexo, que envolve a participação de uma grande quantidade de proteínas, que interagem entre si e com outras moléculas, controlando especificamente o crescimento dos prolongamentos neurais. As semaforinas pertencem a uma família de proteínas responsáveis pelo direcionamento axonal, podendo funcionar tanto como moléculas atraentes, como repelentes nesse processo. São divididas em 8 classes distintas, e compartilham um domínio conservado (sema). As semaforinas de classe 5 são proteínas transmembrana, que compartilham uma sequência de sete domínios tromboespondina. Poucos trabalhos abordam os papéis fisiológicos desempenhados por essa classe, sendo a porção citoplasmática ainda mais negligenciada. O sistema duplo-híbrido é um sistema capaz de detectar interações protéicas in vivo, sendo muito utilizado nos últimos anos. Em trabalhos anteriores, as sequências citoplasmáticas dos domínios Sema 5A e Sema 5B haviam sido clonadas e inseridas em vetor pGilda, sendo esses verificados quanto a sua correta construção. Os plasmídeos que apresentavam insertos corretos foram transformados em leveduras da linhagem RFY 206. As leveduras foram então testadas quanto ao potencial de autoativação dos plasmídeos, sendo verificado que a isca referente à Sema 5A apresentava capacidade de autoativação, o que não foi constatado para Sema 5B. Dessa forma, o presente estudo possuía como objetivo a remontagem da isca referente à Sema 5A, de forma a produzir uma isca incapaz de se autoativar. Entretanto, devido ao maior proveito que o laboratório poderia tirar dos resultados obtidos com Sema 5B, o presente trabalho focou em realizar uma varredura da biblioteca de sistema olfatório (disponível no laboratório), através do sistema duplo-hibrido. Foram então encontradas 50 colônias positivas, que conseguiram ativar ambos os genes repórteres LEU2 e Lac-z utilizados no procedimento. A partir dessas colônias, o plasmídeo presa (pJG4-5) foi extraído, purificado e seqüenciado, sendo os dados analisados , obtendo-se 21 novos possíveis ligantes para Semafonina 5B. A identidade desses novos parceiros moleculares de Sema 5B possibilitará um maior entendimento do papel fisiológico exercido por essa proteína.

 

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