AVALIAÇÃO DA COLONIZAÇÃO DE HERBASPIRILLUM SP EM PLANTAS DE MILHO E ARROZ ATRAVÉS DE QRT-PCR
AVALIAÇÃO DA COLONIZAÇÃO DE HERBASPIRILLUM SP EM PLANTAS DE MILHO E ARROZ ATRAVÉS DE QRT-PCR
Aluno de Iniciação Científica: Jessica Chimene Fernandes (PIBIC/CNPq)
Curso: Biomedicina
Orientador: Maria Berenice Reynaud Steffens
Co-Orientador: Michelle Zibeti Tadra-Sfeir
Colaborador: Rose Adele Monteiro
Departamento: Bioquímica
Setor: Ciências Biológicas
Palavras-chave: Interação planta-bactéria , Herbaspirillum seropedicae , qRT-PCR
Área de Conhecimento: 20000006 - CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Herbaspirillum seropedicae SmR1 é uma bactéria diazotrófica que coloniza gramíneas e por isso é um importante alvo em pesquisas para a agricultura. Este trabalho tem por objetivo realizar a análise quantitativa da colonização de H. seropedicae SmR1 em plantas de milho e arroz. No início do projeto foi realizado treinamento em técnicas de esterilização e germinação de sementes, inóculo da bactéria na planta, coleta das bactérias aderidas ou não à planta, extração de DNA genômico bacteriano e execução de PCR e eletroforese. Sementes de milho Pioneer cv. 30F53 foram esterilizadas por imersão em solução de hipoclorito 12% /Tween 20% seguida de imersão em etanol 70% e três lavagens com água. As sementes foram tratadas com fungicida Vitavax-Thiram (250 µl/L) por 2 horas e germinadas em placas com Agar-água por dois dias. H. seropedicae SmR1, cultivada em meio NFbHPN-malato até D.O.600nm=108 bactérias/mL, foi inoculada nas plântulas que foram então mantidas a 30ºC em incubador rotatório (120 rpm), por 30 minutos. As plântulas foram lavadas duas vezes com salina 1%%, transferidas para tubos contendo miniesferas de polipropileno e mantidas a 26oC por 72-80 horas. As raízes foram coletadas e maceradas em salina 1% para contagem das bactérias, total e endofítico, em placa contendo meio NFbHPN-malato(Sm80). O DNA total foi extraído de raiz macerada em tampão CTAB, e das bactérias do inóculo. A integridade do DNA foi confirmada por eletroforese em gel de agarose 0,8%. O DNA das amostras está sendo analisado por PCR, utilizando o par de primers Y1/Y2 que amplificam 250 pb do gene 16S RNA bacteriano. No estudo com arroz (Oryza sativa L.var.Nipponbare) foram realizados ensaios de adesão e para esterilização das sementes utilizou-se etanol 70%, uma lavagem com solução de hipoclorito 6% e Tween 10% e 10-12 lavagem com água estéril e tratamento com fungicida Vitavax-Thiram (25µl/L) overnight. As sementes foram transferidas para tubos contendo meio Hoagland e miniesferas de polipropileno e mantidas a 26ºC por 72-80 horas. As plantas foram secadas em papel filtro e as raízes foram extraídas e maceradas. Para a contagem das bactérias endofíticas as plantas foram lavadas nas soluções salina 0,9%, álcool 70% e Cloramina 1% e em água. Posteriormente secadas e cortadas para pesagem e diluição seriada do concentrado até 10-4, para plaqueamento meio NFbHPN-malato(Sm80). Como resultado verificou-se a presença de 7,5x105 UFC/ grama de raiz de milho e 5,4x108 UFC/grama de raiz de arroz. Ensaios de qRT-PCR serão realizados com primers para os genes 16S rRNA e rpoC.