Área de Conhecimento: 21104000 - IMUNOLOGIA APLICADA
Os imunoensaios fornecem informações importantes para o diagnóstico precoce e tratamento adequado de uma série de doenças, confirmação de suspeita clínica, acompanhamento do progresso da doença, avaliação da efetividade terapêutica, etc.. Um imunodiagnóstico ideal deve ser de fácil execução, baixo custo e de resultado preciso. Porém, a maioria dos insumos laboratoriais utilizados no Brasil é importada, fato que encarece o procedimento e ao mesmo tempo gera dependência biotecnológica. Os testes diagnósticos movimentam mundialmente cerca de U$ 25 bilhões por ano e, de acordo com o BNDES, o Brasil gasta em média U$ 200 milhões ao ano com insumos. Por isso, faz-se necessária a produção nacional destes reagentes, já que em alguns casos, testes menos precisos são usados de forma a baratear o diagnóstico. Portanto, o objetivo do trabalho foi desenvolver um conjugado, ou seja, um anticorpo policlonal marcado com enzima para utilização em ensaios sorológicos. Para tanto, foram utilizados soros de coelhos imunizados com o bacteriófago M13, um fago filamentoso muito usado em bibliotecas de expressão para clonagem molecular. Ao soro anti M13, adicionou-se sulfato de amônio para a precipitação das IgGs, as quais foram eluídas em uma coluna de proteína G para sua purificação. Os anticorpos foram conjugados à enzima horseradish peroxidase e após a marcação, a viabilidade do uso dessas moléculas foi avaliada por ELISA direto. No primeiro ELISA, após amplificação dos fagos, incubou-se em triplicata, tanto o fago M13 quanto o fago denominado Helper em concentração de 1010 partículas ml-1. Após 1 h de incubação e bloqueio com caseína, adicionaram-se as IgGs marcadas diluídas de 1:25 a 1:3600. No segundo ELISA, para se avaliar a quantidade de fagos mais antigênica, incubaram-se os dois fagos em triplicata, porém em concentrações que variaram de 1010 a 104 partículas ml-1. Desta vez, foram utilizadas imunoglobulinas marcadas na diluição de 1:50. Como resultado, tivemos a produção de 6 ml de IgG conjugada, sendo que o primeiro ELISA mostrou reatividade até a diluição 1:200. A absorbância foi em média de 1,448 para o fago M13 e 0,525 para o fago Helper na diluição 1:25. Apesar, de se ter obtido reatividade, esperava-se que a reação ocorresse até, pelo menos, na diluição 1:1000, a fim de evitar reação cruzada. Embora alguns ajustes sejam necessários, o nosso objetivo de produção de um insumo foi atingido, o que evidencia a viabilidade da produção nacional dessas moléculas.
